Радиационные мутагенез.Закономерность «доза- эффект. Радиационная селекция Радиоактивный мутагенез

В настоящее время общепринято, что за передачу наследственных признаков организма отвечает дезоксирибонуклеиновая кислота - ДНК, в которой четыре основания - тимин, аденин, цитозин, гуанин расположены в определенной последовательности. Согласно этой теории изменение последовательности этих оснований в молекуле ДНК - так называемого кода или их химической структуры приведет к изменению наследственности организма.

В результате проведенных многими авторами экспериментов было установлено, что при воздействии на клетку реагентами - химическими веществами или различными излучениями можно вызвать появление новых признаков у растительных организмов, так называемых мутаций. Они могут возникать в живом организме и спонтанно. В этом случае наиболее вероятными причинами возникновения мутаций являются изменения в физиолого-биохимических процессах, протекающих в самой клетке. Они обычно вызываются в результате изменений внешних условий. Исследования спонтанного мутагенеза показали, что все характерные для него закономерности можно применить и для индуцированного мутагенеза.

Одним из перспективных методов получения искусственных мутаций является радиационный. Радиационная селекция дает возможность в течение относительно коротких сроков получать значительное количество полезных мутантов - примерно около 20% от общего количества новых форм. Кроме того, радиационные излучения дают возможность влиять на отдельные признаки целого растения, не изменяя других, хозяйственно полезных, чего невозможно достигнуть никакими другими методами.

Основоположниками радиационной генетики считаются Г.А. Надсон, Г.С. Филиппов, которые в 1925 г. изучали воздействие ионизирующих излучений на наследственную изменчивость дрожжей.

В 1930 г. в нашей стране наметился активный рост исследований в области получения радиомутантов целого ряда сельскохозяйственных культур. Так, А.А. Сапегин, Л.Н.Делоне провели серию фундаментальных работ по селекции пшеницы. Ими также были освещены некоторые вопросы зависимости мутаций от мощности доз облучения, физиологического состояния организма перед облучением и т.д. Возник вопрос о радиомутабельности различных видов растений, о частоте мутаций отдельных генов. А. Н. Лутковым было установлено, что при γ-облучении наиболее часто отмечаются мутации у генов, регулирующих развитие вегетативных органов, меньше подвергались изменению гены, ответственные за формирование органов цветка.

Большие теоретические разработки в проблеме гена и структурных нарушений хромосомного аппарата в результате воздействия на клетку радиоизотопом выполнены А.С. Серебровским и Н.П. Дубининым.

Активно начатые у нас в стране исследования по радиационной генетике к 1940 г. были практически прекращены. Целые школы генетиков и селекционеров были изгнаны из науки в результате деятельности Т.Д. Лысенко.

В этот период за границей, особенно в Швеции, США, Японии и других странах, были созданы новые, оснащенные современной техникой научно-производственные объединения. Результаты, полученные ими, были весьма значительными. Выведенные новые сорта и гибриды многих сельскохозяйственных культур давали большие прибавки урожая, были более стойки к заболеваниям, технологичны в производстве.

Все это привело к тому, что в начале - середине 50-х годов и в СССР официально была признана теория генной наследственности, а ее сторонники И.П. Дубинин, П.К. Шкварников, С.С. Алиханян, А.М. Кузин и другие получили возможность возобновить свои исследования по решению проблем радиационной генетики и селекции, изучению вопросов влияния различных источников радиации на клетку, как основу и первопричину всех последующих изменений организма.

В 1960-х г.г. ведущими странами уже было выпущено 7 сортов мутантного происхождения, в 1970 - 80, в 1975 г. - около 120, а в настоящее время зарегистрировано более 200 сортов разных культур, имеющих больше хозяйственно-ценных свойств по сравнению с ранее известными сортами. Таких значительных результатов иностранные исследователи добились в немалой степени не только за счет использования одного радиационного мутагенеза, но и его рационального сочетания с химическим мутагенезом. Они развивали оба эти направления, не противопоставляя их друг другу, а взаимообогащая, и это несмотря на то что приоритет химического мутагенеза принадлежит нашим отечественным исследователям - В. В. Сахарову, К. Ф. Магржиковской, В. П. Пономареву, И. А. Рапопорту и др.

Главная цель радиационной селекции - получение большого разнообразия

искусственных мутантов, что недостижимо ни в естественных условиях, ни при применении

химических мутагенов. При радиационном мутагенезе большая часть появившихся признаков

являются неблагоприятными. Часто в результате радиационного воздействия появляются

химерные (уродливые) и угнетенные формы. Однако благодаря дупликациям (изменение

хромосомы, при котором один из её участков линейно представлен два или более раз)

существует определенная вероятность возникновения полезных признаков, таких как высокая

урожайность, измененный химический состав (например, повышенное содержание белка),

скороспелость, устойчивость к полеганию, холоду и высокой температуре, болезням и т. д

(Фокин и др., 2005).

Для получения растений-мутантов требуются сравнительно высокие дозы излучений. В

радиационной генетике, кроме летальной, различают критическую дозу облучения.

Критической называют такую дозу, при которой наблюдается сильное угнетение организмов, но

значительная часть их все-таки выживает и дает большое число мутаций. Ядро клетки более

чувствительно к облучению, чем цитоплазма. Оно может поражаться при дозе, равной всего

нескольким рентгенам, в то время как цитоплазма способна выносить большие дозы. Различие

в радиочувствительности ядра и цитоплазмы может достигать величины 100 000 раз и более.

(Гуляев, 1984). В настоящее время критические дозы установлены более чем для 150

культурных и многих видов диких растений. Критические дозы их колебались от 400 до 200

000Р (Табл. 5).

Как правило, большее количество мутаций удается получить при сублетальных дозах -

дозах, вызывающих гибель примерно у 50 и даже 70% растений. Обычно проявляется

следующая закономерность: чем выше доза, тем большее число мутаций появляется, но при

этом гибель организмов выше. При малых дозах процессы репарации успевают пройти еще во

время облучения и появление мутаций маловероятно; при больших дозах, наоборот, вещества,

индуцирующие изменения, превалируют над репарационными ферментами.Для получения мутаций облучению подвергают семена, пыльцу, проростки, различные

органы растения (в том числе и репродуктивные) на разных этапах органогенеза или целые

растения. Чаще используют облучение семян. Важные факторы лучевого воздействия - вид

излучения, доза и ее мощность, фаза развития растений или состояние семян. При внутреннем

облучении семян их замачивают в растворах радиоактивных веществ. Мутации получают и при

выращивании растений в вегетационных сосудах на питательной среде с добавлением

радионуклидов. Для облучения обычно используют излучения короткоживущих радиоизотопов.

Мутанты, обладающие хозяйственно-полезными свойствами возникают редко. В

большинстве случаев они не являются готовыми сортами, а представляют лишь исходный

материал для селекции. Возможны два основных пути селекционного использования

искусственных мутаций:

· прямое использование мутаций, полученных у самых лучших районированных сортов;

· использование мутаций в процессе гибридизации.

В первом случае ставится задача улучшения существующих сортов по некоторым

хозяйственно-биологическим признакам, исправление у них отдельных недостатков. Этот метод

считается перспективным в селекции на устойчивость к заболеваниям. Метод прямого

использования мутаций рассчитан на быстрое создание исходного материала с нужными

признаками и свойствами. Однако, при высоких требованиях, предъявляемых к современным

селекционным сортам, этот метод достаточно редко дает нужные результаты. Полученный

вследствие мутагенеза исходный материал, как правило, используется в процессе

гибридизации.

Таким образом, создание новых сортов культурных растений под воздействием

ионизирующего излучения складывается из двух этапов. На первом этапе индуцируется

появление максимально возможного количества видоизмененных растений. Второй этап - это

создание новых сортов растений обычными методами традиционной селекции. На разных

этапах онтогенеза могут появляться различные мутации, которые в последующем могут

оказаться благоприятными. В первом поколении, как правило, появляются химерные

(уродливые) формы, более точное представление о выходе мутаций дает второе поколение.

При выращивании перекрестноопыляющихся растений из облученных семян в первом

поколении необходима их строгая изоляция от других растений для предотвращения опыления;

в противном случае мутацию легко утерять.

Частоту и спектр мутаций, индуцируемых определенными мутагенами у данного

объекта, можно существенно менять, т.е. модифицировать. Это достигается путем изменения

режима мутагенной обработки или применения до, во время или после воздействия некоторых

некоторых растений было установлено, что эффект ионизирующей радиации в сильной степени

зависит от того, в присутствии кислорода или без него оно проводится. Оказалось, что

бескислородная среда является защитным средством против ионизации, облучение же в

атмосфере чистого кислорода резко увеличивает процент мутаций (кислородный эффект).

Оказалось, что и после облучения повышение в среде кислорода усиливает повреждающий

эффект ионизации, в то время как в бескислородной среде заметно ослабляется (Гуляев, 1984).

В настоящее время более 1000 разновидностей культурных растений, полученных

методом индуцированных мутаций, выращивают по всему миру на площади в несколько

миллионов гектаров. Методами радиационной селекции получено значительное число новых

ценных сортов зерновых и других культур - горчицы, рапса, томатов, декоративных культур. В

ряде стран выращиваются высокоурожайный горох и ячмень, дающий прочную соломину.

Выведен высокоурожайный, устойчивый к заболеванию ржавчиной, неполегающий овес с

коротким стеблем. Получены формы пшеницы и ячменя с высокой сопротивляемостью к__стеблевой и листовой ржавчине. В нашей стране получены хозяйственно ценные мутанты у

пшеницы: неполегающие, более продуктивные, с повышенным содержанием белка, устойчивые

к грибным заболеваниям формы (Файтельберг-Бланк и др., 1974).

«Экология и здоровье человека» - В ряде регионов антропогенные нагрузки давно превысили установленные нормативы. Многие чистящие средства, например, стиральные порошки содержат фосфатные соединения. Методы урока. Влияние экологических проблем на здоровье человека. Оборудование: слайды презентации видеоматериалы по теме: влияние экологических проблем на человека.

«Среда человека» - Содержание. Охрана природы - важнейшая задача человечества. Загрязнения окружающей среды. Экология… Охрана природы. Окружающая среда. Борьба с грязью.

«Экология человека и его здоровье» - Оценка состояния физического здоровья. Закаливание. Межпредметный курс по экологии. Определение стрессоустойчивости. Предмет элективного курса. Обоснование. Двигательная активность. Викторина. Климат и здоровье. Иммунитет. Создание условий. Профилактика. Правильное дыхание. Оценка подготовленности организма.

«Природа и человек» - В.И. Вернадский. Тема 2: «Взаимодействие человека и природы в разных природных регионах Земли». 1. С.В. Алексеев. М.: Просвещение, 1991. 4. Н.Ф. Реймерс. Если вас заинтересовал курс, Вы можете обратиться по адресу: М., 1990 5. Г.В. Войткевич, В.А. Вронский. М.: Советская Энциклопедия, 1995. Наши занятия будут проходить в форме:

«Экологическая безопасность» - Задачи по решению экологической безопасности. Уравнение. Холерные вибрионы. Анализ. Оцените экологическую ситуацию на объекте. Влияние вредных экологических факторов. Расчет массы аммиака. Лёгкий уровень. Экологическая безопасность. Сложный уровень. Характер ситуации.

Лекция 12

СПОНТАННЫЙ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ

Различают два вида мутагенеза в зависимости от природы этого явления. Один определяется сложностью биохимических и молекулярно-биологических процессов в клетке, другой – внешними факторами среды, в которой организм развивается и осуществляет жизненные функции.

ПРЕДМУТАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Закономерности изменчивости изучены всё ещё недостаточно. Часто мы не знаем, когда и в каком гене произойдёт мутация, какой признак будет изменён, будет ли мутация вредной или полезной для организма.

С другой стороны, вспомним из курса биохимии, что в клетках существует специальная ферментная система репарации, которая исправляет ошибки репликации и таким образом снижает частоту ошибок до 10 –8 – 10 –10 . Однако, принимая во внимание особенности организмов, можно говорить о том, что чем больше геном, тем потенциально большее число спонтанных или индуцированных мутаций может образовываться в нём. При этом показано, что мутагенез происходит даже в сухих семенах и покоящихся клетках, что может быть связано с тем, что ДНК таких биосистем находится в А-форме.

Говоря о предмутационных изменениях, следует помнить о том, что они фактически представляют собой мутации, существующие ограниченное время, за которое ферменты репарации успевают их исправить. И только небольшая часть таких изменений переходит в истинные мутации. Действие дополнительного фактора (даже не мутагенного, напр., температуры) может приводить к увеличению числа наблюдаемых мутаций, поскольку этот фактор нарушает работу ферментов репарации. Такое явление показано, напр., для мушки дрозофилы, у которой число мутаций значительно возрастало, если после облучения рентгеновскими лучами их дополнительно подвергали воздействию повышенной температуры. Явление получило название ЭФФЕКТ ПОСЛЕДЕЙСТВИЯ. При этом не следует забывать о том, что мутации появляются в следующих поколениях.

В завершение необходимо отметить, что хотя изучение мутагенеза методами генной инженерии и является крупным шагом, оно вовсе не избавляет от необходимости исследовать закономерности мутационного процесса на уровне клетки или целого организма.

В предыдущей теме мы говорили о том, что в основе мутаций лежат изменения нуклеотидов, причём мутационный процесс в разных участках хромосом (ДНК) может идти с разной скоростью, которая во многом зависит от наличия там метилированных азотистых оснований. Рассматривая же мутационный процесс в отношении целых организмов, следует сказать о том, что у каждого вида животного, растения или бактерии частота возникновения мутаций и направления мутирования – разные. Эти различия обусловлены влиянием многих факторов: генотипическими особенностями вида, степенью его адаптации к условиям внешней среды, силой действия природных факторов и т.д.

Напр., при изучении мутационного процесса у дрозофилы было установлено, что в целом по организму при учёте видимых, а также разнообразных малых мутаций оказывается, что около 5% гамет в каждом поколении приобретает новые мутации. В отношении отдельных хромосом было выявлено, что в половой Х-хромосоме возникают мутации летального характера с частотой 0,15% за одно поколение, а возникновение мутаций во второй хромосоме происходит с частотой около 0,5%.

Также была выявлена различная мутабильность отдельных генов. Напр., у кукурузы этот показатель для гена красной окраски алейрона составляет 1,1 на 100 тысяч гамет, а для гена, обеспечивающего синтез пигмента антоциана – 182 на 100 тысяч гамет.

Замечено, что сходные гены в разных генотипах мутируют с разной скоростью.

Накопленный экспериментальный материал позволяет говорить о том, что спонтанное мутирование гена в определённой степени зависит от физиологических и биохимических изменений клетки, вызванных влиянием внешних факторов. При этом появление естественных (самопроизвольных) мутаций у микроорганизмов вовсе не требует контакта клетки с тем фактором, по отношению к которому могут появиться мутации, обеспечивающие их приспособительные реакции.

Широко представлены спонтанные мутации у человека. Так, на 1 млн образующихся гамет приходится около 400, несущих мутации по талассемии, 70 – по хондродистрофии, 28 – по альбинизму и цветовой слепоте, 32 – по гемофилии.

К факторам естественного мутационного процесса следует отнести не только ошибки в процессе репликации, транскрипции и трансляции, но и такие, которые могут быть вызваны изменениями физиолого-биохимических процессов в клетке (напр., повышенным образованием пероксида водорода или других веществ подобного действия). При этом ОСНОВУ появления естественных мутаций составляют, по-видимому, факторы внешней среды.

До недавнего времени главенствующую роль в этом процессе отводили естественному радиационному фону, складывающемуся из космических лучей, земной радиации и действия радиоактивных изотопов, попадающих в организм извне, в т.ч. с пищей (напр., Ra, 40 K и т.п.). Величина этого фона составляет 0,12-0,23 рада в год.

Влияние радиации на организмы с коротким жизненным циклом может быть небольшим. Но у человека в ходе онтогенеза до 25% от общего числа мутаций может возникать именно под влиянием естественного радиоактивного фона. Растения, живущие до тысячи лет и более (напр., секвойи), могут испытывать ещё большее влияние этого фактора.

Изучение описываемой проблемы привело к открытию специфических веществ – антимутагенов , обеспечивающих своеобразную защиту организмов от этого фактора, а также иных механизмов, связанных с регуляцией мутационного процесса в целом. Прежде всего, это – открытие генов-мутаторов, способствующих увеличению мутагенного процесса в определённых участках хромосом в 1-2 тысячи раз, что частично связано с изменением механизма действия одного из центральных ферментов репликации ДНК – ДНК-полимеразы. Также показано функционирование гена-антимутатора, который регулирует активность указанного фермента, и этим снижает число мутаций, возникающих при репликации. Аналогичные механизмы воздействия описанных генов показаны и для других белков и ферментов – участников процесса репликации ДНК: ДНК-лигазы, ДНК-связывающих белков и иных белков.

Было также выявлено, что образование мутаций можно генетически заблокировано так же, как и любой другой физиологический процесс. Напр, изменение генов lex A или rec A у бактерии E.coli ведёт к частичному или полному подавлению мутационного процесса под действием ионизирующих излучений, ультрафиолетового света или некоторых химических мутагенов.

ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ

Под индуцированным мутационным процессом понимают возникновение наследственных изменений под влиянием направленного воздействия факторов внешней или внутренней среды. Изменения являются следствием сложных физиологических процессов клетки, в основе которых лежат химические и физико-химические реакции.

Первые результаты в указанном направлении были получены ещё в начале ХХ века. При этом наибольшие успехи были достигнуты в изучении действия ионизирующих излучений, которые были главными объектами исследований физиков того времени.

Открытие Надсона и Филиппова в 1925 году мутагенного действия лучей радия при обработке ими клеток дрожжей начало эпоху индуцированного мутагенеза. Однако основателем этого научного направления считают американского исследователя Мёллера, который первым провёл количественный учёт мутаций этого типа у дрозофилы и таким образом положил начало радиационной генетике как новому научному направлению.

Значительное число исследований на различных объектах привели к развитию теоретических представлений о механизме биологического эффекта лучевого поражения. Граутер ввёл понятие мишени – «чувствительного» объема клетки, поражение которого ответственно за изменение определённой реакции в клетке. Количественный анализ мутагенных эффектов при действии различных доз радиации позволил выявить некоторые закономерности.

В простейшем случае, когда за наблюдаемую реакцию в клетке ответственна одна мишень, для поражения которой необходимо одно попадание, число поражённых клеток растёт экспоненциально с ростом дозы. Уравнение одноударной кривой описывается формулой:

N / N o = 1 – e  D ,

где N o – общее число клеток, N – число инактивированных (погибших) клеток, е – основание натурального логарифма вероятность инактивации в пересчёте на 1 клетку, D – доза радиации.

При одноударном механизме количество мутаций прямо пропорционально дозе:

Если для поражения мишени нужно несколько попаданий, то получают S-образную кривую:

Изучение воздействия разных видов излучения показало их неодинаковую эффективность. Наличие заряда, массы и энергетических характеристик электрона, протона, фотона и других частиц определяют их различное воздействие на клетку, а также величину производимого эффекта при одинаковой дозе излучения. Оказалось также, что для разных организмов, тканей и разных типов мутаций генетическая эффективность указанных видов излучений может быть различной и отличается в десятки ил даже сотни раз.

Присутствие кислорода в среде в момент обучения клетки усиливает мутагенный эффект, поэтому введено понятие о кислородном эффекте излучений. Аналогичное влияние могут оказывать температура, инфракрасное или ультрафиолетовое облучение объекта. При этом эффекты воздействия могут быть разными в зависимости от того, действует ли фактор до облучения, во время оного, или после облучения. Также резко модифицирует эффект воздействия радиации присутствие воды (что показано на семенах различной влажности), присутствие химических реагентов (формальдегида, тяжёлых металлов и т.п.). У человека такими факторами могут быть – присутствие в организме определённых лекарств или защитных веществ (напр., антиокислительной природы).

Внутренние факторы организма также отражаются на величине генетического эффекта радиации. Прежде всего, это связано с фазой клеточного цикла, когда одна и та же доза радиации оказывает разное влияние даже в разные фазы мейоза, что было показано при изучении гаметогенеза у пшеницы.

Характеризуя источники излучения, используют понятие дозы. Дозу рентгеновских и лучей измеряют в рентгенах. Один рентген – это такая доза излучения, при которой в 1 см 3 воздуха при н.у. (0 о С и 1 атм.) образуется 2 млрд пар ионов. На образование одной пары ионов необходима энергия в 34 эВ.

Мощность дозы измеряют в рентгенах в единицу времени (мин., час), т.к. понятно, что чем большее время длится излучение, тем больший эффект оно может производить.

В литературе также используются другие понятия, отражающие нахождение объекта в условиях облучения. Поэтому единицы поглощённой дозы радиации объектом измеряют в Греях (Гр) за какой-либо отрезок времени:

1 рентген = 1 рад = 0,01 Грея.

Мощность поглощённой дозы объектами измеряют в зивертах (Зв), что даёт возможность учёта нахождения объекта на территориях с разным уровнем излучения и в течение разных отрезков времени за определённый период:

1 р/с = 1 БЭР (биологический эквивалент рентгена) = 0,01 Зв.

Данные суммируются, и определяется общая доза излучения, полученная объектом за какой-либо период времени. При этом существуют нормативные документы, которые определяют предельные величины облучения для каждого организма. Так для солдата в боевой обстановке относительно безвредной считает доза в 50 р за месяц. При этом не важно, получена ли она за 1 час или малыми дозами в течение месяца.

Биологическая эффективность воздействия радиации может быть даже теоретически просчитана. Так, чтобы разорвать нить хромосомы толщиной 0,1 мкм, необходимо 15-20 ионизаций, что в пересчёте эквивалентно дозе облучения в 80-100 рентген.

Для характеристики степени загрязнения почвы радиоактивными веществами используют понятие плотности загрязнения почвы, которую выражают в единицах – Кюри (Cu, Ku) на 1 км 2 и соответствует определённой мощности дозы излучения:

1 Ku / км 2 = 1 мкр/час.

ОБ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ (ОБЭ)

РАЗНЫХ ВИДОВ ИЗЛУЧЕНИЙ

ОБЭ одного вида излучений к другому определяют, как соотношение соответствующих доз, вызывающих одинаковый биологический эффект. Эффективность излучения во многом зависит от скорости линейной потери энергии, свойственной каждому виду излучения.

Относительная генетическая эффективность в значительной степени зависит от множества условий в момент облучения или даже после него, о чём говорилось выше. Напр., ОБЭ быстрых нейтронов и рентгеновских лучей на хромосомы в клетках мышей в атмосфере кислорода составляла 2,5 к 1, а при облучении в атмосфере азота – 6 к 1.

В экспериментах на клетках конских бобов установлено, что поражение хромосом нейтронами и -лучами составляет примерно 10,5 к 1, а в отсутствие кислорода – 18 к 1. На другом растении – традесканции показано, что ОБЭ излучений может достигать 100 к 1.

На культуре клеток человека показано, что на всех фазах клеточного цикла рентгеновские лучи вызывают в 1,5 раза больше хромосомных перестроек, чем только -лучи.

ПРОБЛЕМА ПОРОГА МИНИМАЛЬНОЙ

РАДИАЦИИ И МАЛЫХ ДОЗ ОБЛУЧЕНИЯ

Выявленная Мёллером линейная зависимость летальных, сцепленных с полом мутаций у дрозофилы привели к постановке вопроса о проблеме порога, т.е. того минимального уровня радиации, который, как полагали, является безопасным для организмов.

Спенсер и Штерн (1948) показали, что при естественном мутационном процессе у дрозофилы возникает 1 мутация на одну тысячу гамет. Доза радиации в 50 рентген удваивает эту величину. Прямолинейная зависимость дальнейших результатов эксперимента указывала на отсутствие минимального порога дозы.

Наличие естественного радиационного фона и загрязнение окружающей среды радионуклидами за счёт увеличения содержания протонов, напр., изотопа 40 К из-за использования удобрений или аварий вроде Чернобыльской, либо за счёт иных причин, в т.ч. использовании радиоактивных веществ в промышленности или в военном деле, заставляют более тщательно изучать проблему минимальных доз облучения живых существ, в результате чего возникают различные генетические эффекты, вредные для жизнедеятельности организмов.

Биохимические исследования показали, что в клетке существуют специальные ферментные системы репарации наследственного материала для случаев возникновения нарушений в генетическом материале, которые идут с определённой скоростью. При постоянной активной работе такой системы мутации возникают со скоростью 10 –8 – 10 –9 нуклеотидов на одно клеточное деление, что составляет основу спонтанного мутагенеза. Поэтому даже минимальная доза облучения организма только добавляет количество нарушений в генетический материал, и даже при активации системы репарации повреждений общий выход мутаций будет более высоким, чем при обычных условиях.

Когда мы переходим к понятию мощности дозы облучения, т.е. учитываем фактор времени, то оказывается, что генетические эффекты проявляются в любом случае, и это не зависит от действия малых или высоких доз. С одной стороны, это связано с отсутствием нижнего порога радиации, а, с другой, - наблюдается принцип кумуляции (накопления) генетических эффектов за счёт действия малых доз, поскольку мутации являются стойкими изменениями в хромосомах. Поэтому радиационный эффект фенотипически может проявиться раньше при наборе определённой дозы за короткое время, либо – позже, если поглощённая доза набирается за длительный период времени.

Таким образом, высокие и малые дозы облучения различаются в этом аспекте только по уровням мутабильности на единицу облучения. Однако, генетические эффекты воздействия различных доз облучения могут различаться на несколько процентов, в несколько раз или даже десятков и сотен раз в зависимости от типа облучаемой ткани, видовой принадлежности организма, его физиологического состояния.

Цитологические исследования механизма хромосомных перестроек также позволили доказать, что с ростом дозы облучения растёт число нарушений в структуре хромосом (так называемых аберраций, в т.ч. фрагментаций и делеций).

ФЕНОМЕН МАКСИМУМА МУТАЦИЙ

Изучение проблемы роста мутаций с увеличением дозы облучения объекта привело к возникновению вопроса о том, существует ли какой-либо предел максимального числа возможных мутаций. При этом также было установлено, что чем больше энергия частиц и потеря энергии при движении частиц сквозь объект, тем выше величина относительной биологической эффективности излучения. Однако, как оказалось, наступает такой момент, когда энергия частиц настолько велика, что часть их энергии уже не используется, и ОБЭ излучения начинает уменьшаться. В целом кривая зависимости числа мутаций от величины облучения имеет сложный характер: вначале она растёт, достигает плато, а при высоких дозах число мутаций (в расчёте на оставшиеся в живых клетки) снижается.

Это явление было названо феноменом максимальных доз.

Здесь следует привести некоторые уточнения, поскольку в экспериментах происходила накладка факта накопления мутаций и числа погибших после облучения клеток. Объяснение сводится к тому, что вначале происходит накопление мутаций, после чего с дальнейшим ростом дозы гибнут наиболее радиочувствительные клетки, а радиоустойчивые продолжают выполнять свои функции. В конечном итоге их остаётся очень мало, т.е. величина мишени для воздействия излучения значительно уменьшается, что и приводит к снижению наблюдаемого эффекта.

Цитологические и биохимические исследования показали, что при малых дозах облучения возникают, в основном, мутации точечного характера (изменения отдельных нуклеотидов), а число внутригенных делеций (выпадение небольших участков ДНК) пропорционально квадрату дозы.

МУТАГЕННЫЙ ЭФФЕКТ УЛЬТРАФИОЛЕТА

Проблема мутагенного влияния ультрафиолетовых лучей привлекла внимание широкой общественности в связи с исследованиями озонового слоя Земли. Обнаружение озоновых «дыр», их непостоянство в размерах и местоположениях над нашей планетой, с одной стороны, а также расширение возможностей для отдыха в горах и на морском побережье, с другой стороны, значительно повысили актуальность изучения влияния ультрафиолета на жизнедеятельность организмов.

Исследователи делят ультрафиолетовый спектр на три области: УФ-С – жёсткий ультрафиолет с длинами волн менее 280 нм, УФ-В – средний с длинами волн в диапазоне 280-320 нм и УФ-А с длиной волн 320-340 нм. Спектр «жёсткого» ультрафиолета поглощается атмосферой Земли и не достигает её поверхности. «Средний» ультрафиолет может проникать не только через озоновые «дыры», но и при истончении озонового слоя, что вызывается как естественными причинами, так и, по-видимому, антропогенной деятельностью. УФ-А, как полагают учёные, не оказывает вредного воздействия на организмы.

В наибольшей степени мутагенному (и обычно вредному) воздействию УФ-В подвержены микроорганизмы, поскольку эти лучи легко достигают у них ядер с наследственным материалом. Также показано, что мутагенное действие ультрафиолет оказывает и на все другие организмы, если он достигает генеративной ткани или половых клеток (напр., у растений). В то же время показано появление соматических мутаций, не носящих наследственного характера, но вызывающих изменения в функционировании клеток и тканей, что отражается на жизнедеятельности организмов.

Показано, что ультрафиолет способен вызывать все виды мутаций, частота которых зависит от дозы облучения и мощности дозы. Наибольшей эффективностью обладает ультрафиолет с длинами волн в 250-280 нм, что объясняется максимальной способностью ДНК поглощать свет с длиной волны в области 260 нм (благодаря структуре азотистых оснований). Именно поэтому такой ультрафиолет эффективно разрушает молекулы ДНК, что объясняет высокую чувствительность ядер клеток.

Механизм действия связан с образованием димеров, в основном, тимина, а также – цитозина, уридина и даже между Т и Ц. Всё это приводит к нарушениям функций ДНК, касающихся не только транскрипции, но и процесса репликации.

Иной механизм действия ультрафиолета состоит в том, что при его воздействии на водную среду клетки происходит образование пероксида водорода (Н 2 О 2) и органических пероксидов, также оказывающих мутагенный эффект на наследственный материал клетки. Напр., в экспериментах на E.сoli показано, что при её выращивании на среде, предварительно облучённой ультрафиолетом, частота мутаций в клетках возрастает в 50-100 раз. Снижение содержания кислорода при выращивании кишечной палочки на предварительно облучённой среде или снижение концентрации кислорода во время облучения среды значительно уменьшают образование пероксидов и частоту мутаций у микроорганизма.

Защитным действием против воздействия ультрафиолета обладает видимый спектр света (фотореактивация), и экспериментально доказана его способность подавлять мутагеннй эффект ультрафиолета. Видимый свет также способен частично подавлять действие ионизирующих излучений, поскольку он стимулирует активность ферментов, снижающих концентрацию различных пероксидов. К числу таких ферментов относятся, напр., каталазы и цитохромоксидазы.

Эффективность фотореактивации также зависит от иных факторов: рН среды, температуры, физиологического состояния клетки, а также особенностей генотипа.

ХИМИЧЕСКИЙ МУТАГЕНЕЗ

Мутагенный эффект химических соединений был открыт в середине ХХ столетия. На личинках одной из линий мухи дрозофилы было показано, что формальдегид индуцировал появление летальных мутаций примерно в 6% случаев. Далее было выявлено мутагенное действие иприта – отравляющего вещества, использованного в период Первой мировой войны. При этом было показано, что химические вещества могут вызывать не только все виды точковых мутаций, но и хромосомные перестройки.

К настоящему времени известно довольно много веществ, обладающих таким свойством. В то же время использование конкретного вещества определяется в первую очередь целью эксперимента. При этом мутагенность химического соединения определяется, во-1-х, возможностью его проникновения в клетку при сохранении её жизнеспособности и, во-2-х, способностью достигать ядра клетки, влиять на структуру и/или функции хромосом, и иные химические процессы в клетке.

Также следует учитывать дозировку, агрегатное состояние вещества, особенности объекта исследования, стадию развития организма, а для половых клеток – стадию гаметогенеза. Иногда мутагенное действие вещества может проявиться только при определённом методе его введения в организм. Так, если формальдегид использовали в качестве пищевой добавки для личинок мухи дрозофилы, то обнаруживали его мутагенное действие. В экспериментах с воздействием паров этого вещества на личинки или взрослые особи мутагенное действие формальдегида не проявлялось.

Большое число химических мутагенов даёт основание для попыток их классификации либо по химической структуре, либо по эффекту действия.

Так, Н.П.Дубинин выделяет 9 основных классов химических мутагенов, среди которых отмечает:

алкилирующие соединения;

пероксиды;

альдегиды;

соли тяжёлых металлов;

аналоги оснований ДНК;

красители

По химическому действию выделяют следующие группы веществ:

радиомиметические, поскольку их мутагенное действие подобно действию ионизирующих излучений (напр., формальдегид, этилметансульфонат и др.);

пероксиды, активными компонентами которых являются радикалы –ОН, -Н, НО 2 -, образующиеся из пероксидов при воздействии таких факторов как кислород, вода, ультрафиолет, видимый свет;

аналоги метаболитов, механизм действия которых состоит в конкуренции с обычными метаболитами и их замещении. Это, напр., производные пуриновых и пиримидиновых оснований – бромурацил, аминопурин, а также производные витаминов, напр., фолиевой кислоты и т.д.;

недостаточно изученные вещества, механизм действия которых не вполне ясен.

В завершение следует также подчеркнуть, что ионизирующие излучения, ультрафиолет и химические мутагены вызывают образование мутаций, которые наиболее полно проявляются в зиготе второго поколения, если они произошли в генеративных клетках. Этот феномен получил название явления отсроченных мутаций.

КОМПЛЕКСНОЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ

Исследование влияния отдельных факторов внешней среды на наследственную изменчивость раскрывает лишь некоторые стороны их влияния на мутационный процесс. Гораздо более сложную картину для интерпретации представляют результаты по комплексному воздействию сразу нескольких факторов, что обычно имеет место в природе. Поэтому для оценки вклада каждого из факторов ставят специальные эксперименты таким образом, чтобы в одной серии опытов варьировал в относительно широких пределах только один из факторов, а другие оставались примерно на том же уровне. Полученные результаты обрабатывают с помощью специальных статистических методов, которые позволяют оценить вклад каждого в отдельности из факторов в мутационный процесс.

Напр., в опытах на арабидопсисе изучали взаимодействие ультрафиолета и видимого света на мутационный процесс у ряда генетических форм этого растения. В качестве оценочной характеристики использовали показатель – выживаемость растений. В экспериментах варьировали мощность и продолжительность действия ультрафиолета, а также восстановительные свойства видимого света. Было установлено, что устойчивость растений к губительному действию ультрафиолета на 22% определяется особенностями генотипа и на 18% интенсивностью видимого света (ФАР – фотосинтетически активной радиации).

Особое значение подобные эксперименты представляют с точки зрения прогнозирования последствий, вызываемых воздействием факторов на биоценозы, для которых на основании полученных результатов могут быть построены теоретические модели. Это даёт возможность не только предвидеть негативные события в ценозе, но и главное – позволит формулировать реальные пути их предотвращения в целях сохранения биосферы Земли в целом или отдельных составляющих её компонентов.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУТАГЕНЕЗА В ЦЕЛЯХ СЕЛЕКЦИИ

Открытие искусственного (индуцированного) мутагенеза нашло практическое применение в селекции несколько позже (с 50-х годов ХХ века), когда стали ясны некоторые механизмы этого процесса и разработаны методы отбора мутантов. Получение радиационных и химических мутантов сельскохозяйственных растений позволило получать ценные сорта, обладающие целым комплексом положительных свойств: устойчивостью к полеганию, болезням, низким температурам, повышенной хозяйственной продуктивностью и т.д.

Особое значение индуцированный мутагенез приобрёл в селекции микроорганизмов. Фактически вся микробиологическая промышленность по производству антибиотиков, аминокислот, витаминов и т.п. построена на использовании радиационных, химических и «ультрафиолетовых» мутантов.

Важные мутанты были получены у тутового шелкопряда, производящего натуральный шёлк.

Индуцированные мутации, вызванные облучением, впервые были получены советскими учеными Г. А. Иадсоном и Г. С. Филипповым, которые в 1925 г. наблюдали мутационный эффект на дрожжах после воздействии на них радиевыми лучами. В 1927 г. американский генетик Г. Меллер показал, что рентгеновы лучи могут вызвать множество мутаций у дрозофилы, а позже мутагенное действие рентгеновых лучей подтвердилось на многих объектах. В дальнейшем было установлено, что наследственные изменения вызываются также всеми другими видами проникающей радиации. Для получения искусственных мутаций часто используются гамма-лучи. В последнее время для индуцирования мутаций все шире применяются нейтроны, обладающие большой проникающрй способностью. При этом возникают как разрывы хромосом, так и точковые мутации. Изучение мутаций, связанных с действием нейтронов и гамма-лучей, представляет особый интерес по двум причинам. Во-первых, установлено, что генетические последствия атомных взрывов связаны прежде всего с мутагенным влиянием ионизирующей радиации. Во-вторых, физические методы мутагенеза используются для получения ценных в хозяйственном отношении сортов культурных растений. Так, советские исследователи, используя методы воздействия физическими факторами, получили стойкие к ряду грибковых заболеваний и более урожайные сорта пшеницы и ячменя.

Общая закономерность: с увеличением дозы - увеличивается степень повреждения системы; в процесс вовлекается все большее число составляющих её элементов. В зависимости от действующей дозы практически всякое вещество в определенных условиях может оказаться вредным для организма. На проявление зависимости "доза-эффект" оказывает существенное влияние внутри- и межвидовая изменчивость организмов. Действительно, особи, относящиеся к одному и тому же виду, существенно отличаются друг от друга по биохимическим, физиологическим, морфологическим характеристикам. Эти отличия в большинстве случаев обусловлены их генетическими особенностями. Еще более выражены, в силу тех же генетических особенностей, межвидовые различия. В этой связи дозы конкретного вещества, в которых оно вызывает повреждение организмов одного и того же и, тем более, разных видов, порой очень существенно различаются. Следовательно, зависимость "доза-эффект" отражает свойства не только токсиканта, но и организма, на который он действует. На практике это означает, что количественную оценку токсичности, основанную на изучении зависимости "доза-эффект", следует проводить в эксперименте на различных биологических объектах, и обязательно прибегать к статистическим методам обработки получаемых данных.

1. Мутагенная роль химических веществ

2. Действие излучения

3. Закон гомологических рядов

1. Открыты сотни химических мутагенов. Некоторые из них уси­ливают мутагенный эффект во много раз по сравнению со спонтанными и называются супермутагенами. В экспериментах мутации индуцируются разнообразными химическими агента­ми. По-видимому, и в естественных условиях подобные фак­торы служат причиной появления спонтанных мутаций у раз­личных организмов, в том числе у человека. Доказана мутагенная роль различных химических веществ и даже некоторых лекарственных препаратов, что говорит о не­обходимости изучения мутагенного действия новых фармако­логических веществ и других химических соединений, широко используемых в медицине и сельском хозяйстве. Химические мутагены обладают тремя качествами :

Высокой проникающей способностью;

Свойством изменять коллоидное состояние хромосом;

Определенным действием на состояние гена или хромосомы.

2. Индуцированные мутации, вызванные облучением (радиацией),

впервые были обнаружены советским ученым Г.А. Надсоном. Для вызывания искусственных мутаций часто используются гамма-лучи, источником которых может быть, например, ра­диоактивный кобальт. Облучение индуцирует как генные му­тации, так и структурные хромосомные перестройки всех опи­санных выше типов - нехватки, инверсии, удвоения и т. д. Все структурные изменения связаны с разрывом хромосом. При­чиной этого являются некоторые особенности процессов, про­исходящих в тканях при действии излучения. Жесткие излучения вызывают в тканях ионизацию, в результа­те которой :

Одни атомы теряют электроны;

Другие присоединяют их;

Образуются положительно или отрицательно заряженные ионы. Подобный процесс внутримолекулярной перестройки, если он происходит в хромосомах, может привести к их фрагментации. Доказано, что связь между облучением и мутационными измене­ниями может носить и непрямой характер. По-видимому, энер­гия излучения может вызывать в среде, окружающей хромосо­му, химические изменения, которые ведут к индуцированию генных мутаций и структурных перестроек в хромосомах. Одно из самых опасных последствий облучения - образование свободных радикалов ОН или НО2 при радиолизе воды, нахо­дящейся в тканях. Эти радикалы обладают высокой реакцион­ной способностью и могут воздействовать на многие органиче­ские вещества, в том числе нуклеиновые кислоты.

3. Многообразие мутирования подчиняется определенным зако­номерностям, которые впервые были обнаружены в 1920 г. Н.И. Вавиловым. При сравнении признаков различных сортов культурных растений и близких к ним диких видов обнаружилось много общих наследственных изменений, что позволило Вави­лову сформулировать закон гомологических рядов в наследст­венной изменчивости: "Виды и роды, генетически близкие, ха­рактеризуются сходными рядами наследственной изменчивости с такой правильностью, что, зная ряд форм в пределах одного ви­да, можно предвидеть существование параллельных форм у других видов и родов". Вавилов указывал, что гомологические ряды часто выходят за пределы родов и даже семейств.

Закон гомологических рядов в наследственной изменчивости име­ет прямое отношение к изучению наследственных болезней у человека. Вопросы лечения и профилактики наследственных заболеваний не могут быть решены без широкомасштабных исследований на животных с наследственными аномалиями.

Согласно закону Вавилова, мутации, аналогичные наследствен­ным болезням человека, должны встречаться у животных. Так, у собак наблюдается гемофилия, сцепленная с полом. Альби­низм зарегистрирован у многих видов грызунов, кошек, собак и птиц. Моделями для изучения мышечной дистрофии могут слу­жить мыши и крупный рогатый скот, эпилепсии - кролики и крысы, аномалий в строении глаз - многие виды грызунов, собаки и свиньи. Наследственная глухота обнаруживается у морских свинок, мышей и собак. Аномалии, аналогичные за­ячьей губе и волчьей пасти, бывают у мышей, собак, свиней.